Tujuan
Mahasiswa diharapkan dapat melakukan identifikasi asam – asam amino yang terdapat pada protein hasil hidrolisis (hidrolisat protein) dengan teknik kromatografi lapis tipis.
Dasar Teori
Hidrolisis protein adalah hasil hidrolisis protein baik oleh panas, asam maupun air menjadi asam amino penyusunan. Asam – asam amino akan mengalir dengan pelarut di permukaan lapisan tipis silica sampai akhirnya aliran tersebut terhenti, karena terjadi absorbsi asam amino di permukaan lapisan tersebut. Kecepatan aliran dan absorbsi tiap asam amino berbeda – beda karena perbedaan kimiawi masing – masing asam amino. Dengan menggunakan asam amino yang sudah diketahui sebagai pembanding dapat diketahui apakah asam amino semacam terkandung di dalam larutan yang di uji. Ninhidrin dipakai sebagai pereaksi penampak noda karena reaksi ninhidrin dengan asam amino menghasilkan warna khas ungu – biru sampai kecoklatan atau kuning tergantung pada jenis asam aminonya. Dengan menggunakan teknik kromatografi, berbagai asam amino dalam hidrolisat protein dapat diidentifikasi.
Alat dan Bahan
- Lempeng KLT
- Bejana KLT
- Gelas Ukur
- Oven
- Botol Penyemprot
- Hidrolisat protein
- Beberapa asam amino sebagai standar
- Pelarut (n-butanol : asam asetat glacial: akuadestilata dalam perbandingan 2 : 1: 1)
- Larutan ninhidrin 0,3 % dalam aseto
Cara Kerja
- Isi bejana KLT dengan pelarut yang sudah disediakan setinggi 1,5 cm. kemudian ditutup. Biarkan beberapa saat supaya uap pelarut memenuhi ruang bejana tersebut.
- Siapkan lempeng KLT sebelum digunakan dan dipilih yang baik.
- Teteskan hidrolisat protein dan asam amino yang sudah diketahui masing – masing berjarak 2 cm satu sama lain dan 2 cm dari ujung bawah lempeng. Cara p[enetesan adalah sebagai berikut:
- Sentuhkan dahulu ujung pipa kapiler yang berisi hidrolisat protein diatas kertas tisu, kemudian barulah ditempat yang sudah ditentukan. Lakukan beberapa kali penetesan sampai agak pekat setelah penetesan pertama kering. Ulangi cara tersebut dengan menggunakan pipa kapiler berisi asam amino yang telah diketahui.
- Letakkan lempeng KLT dengan hati – hati dalam bejana yang telah berisi pelarut. Posisi lempeng tegak lurus dengan bagian yang berbintik di bawah. Tutup bejana dan biarkan pelarut mengalir ke atas dan jangan di buka selama pelarut belum sampai pada batas yang telah ditentukan.
- Keluarkan lempeng keringkan di udara atau dengan alat pengering selama 3 – 5 menit atau sampai kering benar.
- Semprot perlahan – lahan permukaan lempeng tersebut dengan larutan ninhidrin dari jarak ± 45 cm. Lakukan penyemprotan dengan hati – hati dan hindari penyemprotan yang berlebihan.
- Biarkan mengering 2 -3 menit, selanjutnya dikeringkan di dalam oven 100oC selama 2 -3 menit sampai muncul bintik – bintik (spot) yang berwarna.
- Keluarkan lempeng dari oven, dinginkan dan amati serta ukur jarak noda dan hitung Rf masing – masing asam amino.
Hasil
Jenis Asam Amino
|
Jarak Noda (cm)
|
Rf
|
Jenis Asam Amino
|
Jarak Noda (cm)
|
Rf
|
Sampel A
|
2,3
|
0,23
|
LEU
|
5,7
|
0,57
|
Sampel B
|
3,2
|
0,32
|
TYR
|
5,1
|
0,51
|
ALA
|
3,7
|
0,37
|
TRP
|
5,2
|
0,52
|
ARG
|
2,2
|
0,22
|
GLI
|
3,2
|
0,32
|
Pembahasan
Kromatografi lapis tipis adalah pemisahan zat berdasarkan kepolarannya, prinsipnya ada dua yakni partisi dan absorbsi. Bila fase diam berupa zat padat yang aktif, maka dikenal istilah kromatografi penyerapan (adsorption chromatography). Bila fase diam berupa zat cair, maka teknik ini disebut kromatografi pembagian (partition chromatography). Metodenya ada dua fase gerak ( pelarutnya ) dan fase diam ( sampelnya ). Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau kombinasi cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda.
Sebelum kertas kromtografi dimasukan kedalam chamber terlebih dahulu kertas tersebut dibagi dua pula, kemudian digaris sebagai tanda tempat penotolan dan tanda batas kertas yang diamati. Setelah itu kedua kertas tersebut ditotolli dengan alanin, glisin,asam aspartat dan sampel uji lainnya. Setelah proses di atas selesai maka dimasukanlah kedua kertas yang telah ditotoli dengan asam amino dan sampel uji tadi. Dari hasil pengamatan diperoleh hasil di atas yaitu Rf dari masing-masing asam amino yaitu sampel A 0,26 cm, sampel B 0,47, alanin 0,4 cm, arginin 0,25 cm, leusin 0,57 cm, tyrosin 0,51 cm, triptofan 0,52 cm, dan glisin 0,32 cm. Dalam melakukan percobaan ini didasari dengan rumus perhitungan perbandingan kecepatan antara noda tempat penotolan dengan jarak yang ditempuh oleh pelarut Rf (.Rate of front) Rf = Jarak noda dari tempat penotolan/Jarak yang ditempuh oleh pelarut.
Kesimpulan
Untuk asam amino didapatkan hasil yang berbeda-beda, semakin besar jarak asam amino yang didapat maka semakin besar polar tersebut.
Jalip, Ikna Suyatna. 2011. Penuntun Praktikum Biokimia Laboratorium Kimia. Universitas Nasional Jakarta
DAFTAR PUSTAKA
0 comments:
Post a Comment